PGR
PGR – polimerazinė grandininė reakcija (angl. PCR; Polymerase chain reaction) – tai molekulinės biologijos metodas, leidžiantis padauginti (amplifikuoti) DNR in vitro (mėgintuvėlyje).
Pradmenys
Norint padauginti esamą DNR seką, reikia žinoti, kokie nukleotidai yra jos galuose. Pirmiausia cheminiais metodais susintetinami du pradmenys, iš kurių pirmasis atitinka dauginamos sekos pradžią, o antrasis – kitos (papildančios) DNR grandinės pabaigą. Dauginama DNR yra dvigrandė, taigi abu pradmenys joje turi savo prikibimo vietas.
DNR polimerazė
Greta pradmenų, į reakcijos tirpalą dedama DNR polimerazės ir visų jai veikti reikalingų cheminių medžiagų. Kadangi mišinys bus kaitinamas, šis fermentas turi būti iš karščiui atsparaus organizmo.
Šios reakcijos sąlygomis DNR polimerazė tuomet gali sintetinti DNR grandinę, tęsdama ją nuo prikibusio pradmens:
DNR polimerazė negali pradėti sintezės bet kurioje DNR vietoje. Naujai sintetinamos DNR seka komplementari (A prieš T, T prieš A, G prieš C ir C prieš G) kaip matrica naudojamos senos DNR sekai.
Reakcijos žingsniai
- Reakcijos tirpalas pakaitinamas tiek, jog dauginamos DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.
- Tirpalas vėl atvėsinamas. Dalis dauginamos DNR grandinių vėl sukimba, tačiau kitais atvejais ties dauginamą fragmentą ribojančiomis sekomis ant dauginamos DNR užsėda tą seką atitinkantys pradmenys.
- Tirpale esanti DNR polimerazė atpažįsta pradmenis ir pradeda juos tęsti, sintetindama naują DNR. Gaunamos dvigrandės DNR, kurių viena grandinė yra naujai susintetinta (padauginta).
- Reakcijos tirpalas vėl pakaitinamas, kad DNR grandinės atšoktų viena nuo kitos. Gaunamas tirpalas, panašus į turėtą pirmąjame metodo žingsnyje, tačiau viengrandžių DNR fragmentų jau yra daugiau (prie anksčiau buvusių prisideda naujai susintetinti). Galima tęsti antrą ir po jo sekančius algoritmo žingsnius, kiekvieną kartą kaupiant vis daugiau DNR:
Kiekvienąkart pakartojus algoritmą, DNR tirpale padaugėja maždaug dvigubai. Todėl reakcija vadinama grandinine.
Galimybės
Norint šiuo metodu padauginti DNR fragmentą, pakanka žinoti jo kraštų sudėtį; ilgis ir vidurio seka gali būti nežinomi. Tačiau DNR polimerazė kartais daro klaidas, todėl jei DNR dauginama sekai nustatyti, PGR ir po to sekantį sekos nustatymą reikia kartoti mažiausiai dukart.
PGR leidžia amplifikuoti mažą DNR kiekį iki reikiamo kiekio tolimesniems tyrimams (ligų detekcijai, tėvystės nustatymui, genų klonavimui ir kt.) Juo galima patikrinti, ar tiriamame genome yra dviem žinomais pradmenimis apribota seka ir taip nustatyti, ar šis organizmas turi (ar galbūt evoliucinėje praeityje turėjo) žinomos sekos geną. Kai kada skirtinguose organizmuose skiriasi pradmenimis apribotos sekos ilgis. Kadangi padaugintos sekos ilgį nustatyti nesunku, tokios sekos naudojami kaip „dirbtiniai genai“, kurių atžvilgiu (panaudojant persikryžiavimo dėsnius) nustatoma su paveldimomis ligomis ar šiaip išoriškai stebimais požymiais susijusio geno padėtis.
Įprastiniu PGR gali būti padauginamas ne ilgesnis kaip keleto tūkstančių nukleotidų porų fragmentas.
Variantai
Naudojant atvirkštinę transkriptazę, galima gauti PGR reakciją, kurios pradinė matrica yra RNR.
Būtini komponentai
PGR reakcijos tirpale turi būti DNR matrica, pradmenys, dNTP, DNR polimerazė, buferinė sistema, kofaktorius Mg2+. Taip pat reikalingas specialus prietaisas (termocikleris), kuris periodiškai keičia reakcijos tirpalo temperatūrą.
Įdomybės
Praeityje lietuvių biochemikai pasigamindavo šį prietaisą iš kompiuterinio spausdintuvo, priversdami jo galvutę kilnoti mėgintuvėlį po skirtingos temperatūros tirpalus. Parašydavo jie ir tam reikalingą programinę įrangą.
| ||||||